細胞培養過程中支原體檢測方法如約而至

第三期來啦！

還沒有看前兩期內容的小伙伴

可以看我之前發的：支原體常規檢測方法匯總（一）、支原體常規檢測方法匯總（二）

上回書和上上回書說道

qPCR檢測法是一種目前比較常用

效果也比較可靠的方法

那除了qPCR

還有沒有其他方法可以檢測呢？

所以今天就來講講

分離培養法和DNA染色法

有請兩位主角閃亮登場

01、分離培養法

簡單來說，這種方法的基本原理就是：分離，然后培養

聽君一席話如聽一席話，展開來講，就是從可疑的細胞培養體系中取樣，接種到適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會在這種瓊脂平板上快速生長，最終形成明顯可見的特征性菌落。

操作規范的情況下，這種方法很少會出現假陰性結果，檢測精確度很高，因此被譽為支原體檢測金標準。

缺點就是檢測時間太長，支原體要長出明顯克隆至少需要4周時間。另一方面，盡管可以檢測絕大多數支原體種類，分離培養法也有力所不及的時候，例如支原體M. Hyorhinis。因此，該方法能鑒定的支原體種類有限，成為它的另一個缺點。

02、DNA染色法

該方法的實驗思路是：培養指示細胞、樣品上清液收集、上清液接種、染色觀察結果

這一波操作看起來有點復雜，那展開說說：

將供試品接種于指示細胞（無污染的Vero 細胞或經國家藥品檢定機構認可的其他細胞，供試品應對該細胞生長無影響。下面以Vero細胞為例）中培養后，用特異熒光染料（如Hoechst 33258）染色，支原體中的核酸也可以被著色，因此，如果待檢測細胞中含有支原體，那么就會導致指示細胞被感染，進而在細胞膜或培養基等處發現藍色熒光（支原體附著在細胞膜上，也有可能游離在細胞培養基中）。

指示細胞培養：將指示細胞復蘇、傳代，調整至最佳狀態，留出適宜的量備用。

樣品上清液收集：無抗生素培養基中加入待檢測樣品后，細胞需至少傳一代，然后取細胞已長滿且3 天未換液的細胞培養上清液待檢。（為了對待檢測樣品中的支原體進行富集）

上清液接種：在制備好的指示細胞培養板中加入一定量的待檢細胞培養上清，36°C培養3-5 天。指示細胞培養物至少傳代1 次，末次傳代培養可用6孔板培養3-5 天。

染色觀察：吸出培養孔中的培養液，加入固定液，放置5分鐘。吸出固定液后進行10min的二次固定，再次吸出固定液，使蓋玻片在空氣中干燥。加DNA 染料工作液5ml，加蓋，室溫放置30分鐘，漂洗3次，干燥，封片。用熒光顯微鏡觀察。

熒光顯微鏡下可見細胞表面或培養基中，有大小不等、不規則的藍色熒光著色顆粒，則說明有可能存在支原體污染。

對于DNA染色法方法，優缺點也是很明顯的：

優點：

1、適用于一些不易培養的支原體，如豬鼻支原體，分離培養法對該支原體檢測并不可靠，但可用DNA染色法準確地檢測出來。

2、操作步驟雖然多，但都相對簡單

3、靈敏度尚可。

缺點：

1、時間較長，從Vero細胞復蘇、傳代，再到收集上清后再次培養，有時甚至需要十幾天時間

2、存在假陽性和假陰性的可能：如一些死亡細胞釋放出來的DNA會被染成藍色，出現假陽性；或是由于熒光過若而出現假陰性使結果出現偏差，因此使用這個方法需要一定的經驗。