葉酸的檢測方法有許多種，主要根據測定試樣來決定其測定方法。若測定葉酸藥劑或制品中的葉酸含量，通常可采用高壓液相色譜法、比色法、熒光分析法、紫外分光光度法以及薄層層析法等。若測定食品或植物中的游離葉酸，一般都采用微生物測定法。

　　常用的檢測葉酸的干酪乳桿菌葉酸測定用培養基菌株有鼠李糖乳桿菌ATCC7469、糞鏈球菌以前被稱為ATCC8043、啤酒小球菌ATCC8081。此3種微生物對不同形式葉酸的敏感度不同。糞鏈球菌只對非甲基化葉酸敏感，如葉酸(PteGlu)、二氫葉酸(DHF)和四氫葉酸(THF)，可用于鑒別分析各種形式葉酸在不同檢測物中的分布。啤酒小球菌對甲基化葉酸也不敏感。鼠李糖乳桿菌對單谷氨酸葉酸、含2或3個谷氨酸葉酸及其還原型衍生物均敏感，是3種微生物中反應譜帶寬的一種，也是常用的菌種。

　　各種微生物生長需要有一些微量的專一生長因子，它們可能是維生素或氨基酸等。根據這種需求性為基礎，設計出各種生長因子的定量法，選擇那些以必需定量的營養物為必需生長因子的菌株，制備好*不含該營養物的定量培養基，再分別在干酪乳桿菌葉酸測定用培養基上加入標準營養物和待測樣品，并定量地接種菌株進行培養。然后根據微生物生長隨營養物加入量的不同而變化的情況，就可以對樣品中的營養物進行定量。定量的方法有比濁法、酸度滴定法（試管法）、瓊脂平板擴散法和質量法等。